Latar Belakang : Rumah sakit merupakan institusi pelayanan kesehatan yang menyelenggarakan pelayanan kesehatan perorangan secara promotif, preventif, kuratif dan rehabilitatif. Peran preventif rumah sakit salah satunya adalah mencegah timbulnya infeksi nosokomial yang disebut dengan Healthcare Associated Infections (HAIs). Kebersihan sarana dan prasarana merupakan salah satu upaya untuk mencegah terjadinya (HAIs), sehingga pengetahuan petugas kebersihan mengenai kebersihan sarana dan prasarana sangatlah penting. Berdasarkan data WHO tahun 2005 diperoleh data proporsi kejadian Infeksi nosokomial meningkat sekitar 9% pada pasien rawat inap di seluruh dunia dan di Indonesia meningkat sebesar 39% - 60%. Tujuan Penelitian: Untuk mengetahui pengaruh edukasi tentang kebersihan sarana dan prasarana rumah sakit dalam meningkatkan pengetahuan petugas kebersihan di RS. Hidayatullah dan RS. Nur Hidayah Yogyakarta. Metode: Penelitian ini merupakan jenis penelitian kuantitatif dengan desain penelitian Quasi Eksperimen Pre-test Post-test Control Group Design. Sampel penelitian ini yaitu para petugas kebersihan di RS. Hidayatullah yang berjumlah 12 orang dan petugas kebersihan di RS. Nur Hidayah yang berjumlah 15 orang yang diambil dengan teknik total sampling. Analisis data yang digunakan adalah uji hipotesis Wilxocon untuk melihat pengaruh pemberian perlakuan terhadap kelompok perlakuan dibandingkan dengan kelompok kontrol. Hasil dan Pembahasan: Terdapat perbedaan tingkat pengetahuan pada kelompok perlakuan yang ditunjukkan dengan nilai rerata pre-test 5,67 dan post-test 8,92, sedangkan pada kelompok kontrol tingkat pengetahuan tidak mengalami perubahan yang signifikan yang ditunjukkan dengan nilai rerata pre-test 8,13 dan nilai rerata post-test 8,60. Pada penelitian ini didapatkan hasil nilai P pada kelompok perlakuan( p=0,034 atau p<0,05) dan pada kelompok kontrol nilai P yaitu (p= 0,705 atau p>0,05). Kesimpulan: Edukasi terbukti berpengaruh dalam meningkatkan pengetahuan petugas kebersihan di RS. Hidayatullah dan RS. Nur Hidayah.