Latar Belakang: Pencegahan dan Pengendalian Infeksi Rumah Sakit (PPIRS) adalah kegiatan yang meliputi perencanaan, pelaksanaan dan pengawasan dalam upaya menurunkan angka kejadian infeksi nosokomial. Kebersihan tangan (hand hygiene) merupakan komponen terpenting dari Kewaspadaan Standar dan merupakan salah satu metode yang paling efektif dalam mencegah kejadian infeksi nosokomial. Mencuci tangan menggunakan antiseptik dapat menurunkan angka kuman sebesar 89,3%. Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi efektivitas antiseptik antara lain faktor antiseptic, mikroba, lingkungan, dan waktu pemaparan. Faktor lingkungan itu sendiri merupakan penunjang terjadinya infeksi nosokomial bagi pasien yang dirawat di lingkungan berbeda. Faktor lingkungan itu antara lain adalah air, bahan udara yang harus dibuang (disposial), dan udara. Metode Penelitian: Metode penelitian yang digunakan adalah quasy eksperiment dalam satu kelompok (one group pre test - post test design) dengan pendekatan cross sectional. Penelitian ini dilakukan dengan pengambilan sample usapan angka kuman pada telapak tangan tenaga medis sebelum dan sesudah melakukan cuci tangan yang dilakukan di RSUD Kota Yogyakarta pada bulan Mei-November 2016. Semua sampel usapan angka kuman diperiksa di Laboratorium Mikrobiologi FKIK UMY. Besar sampel total yang digunakan adalah sebanyak 20 sampel. Data selanjutnya dianalisis dengan uji Kruskall-Wallis. Hasil Penelitian: Analisa data menggunakan Kruskal-Wallis menunjukkan p value = 0,949. Jumlah angka kuman menunjukkan hasil tertinggi pada penempatan antiseptik di zona tinggi dengan rata-rata penurunan angka kuman 1812,5±2031 CFU/cm2, kemudian diikuti zona sangat tinggi dengan rata-rata penurunan angka kuman 1487,5±1705 CFU/cm2, zona sedang dengan rata-rata penurunan angka kuman 1162,5±1140,17 CFU/cm2, dan zona rendahdengan ratarata penurunan angka kuman 887,5±527,37 CFU/cm2. Kesimpulan: Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa terdapat perbedaan angka kuman pada petugas medis sebelum dan sesudah melaksanakan hand hygiene, tidak terdapat pengaruh penempatan antiseptik terhadap efektivitas hand hygiene berdasarkan angka kuman di RSUD Kota Yogyakarta. Jumlah angka kuman menunjukkan hasil terttinggi pada penempatan antiseptik di zona resiko tinggi (IGD), kemudian zona resiko sangat tinggi (ICU), lalu zona resiko sedang (bangsal KIA Kenanga) dan terendah di zona resiko rendah (ruang administrasi PPI).