Latar Belakang: Penyakit infeksi masih merupakan salah satu masalah kesehatan dunia. Sekitar 8,7% dari pasien memiliki infeksi nosokomial dari 55 rumah sakit dari 14 negara yang mewakili daerah World Health Organization (WHO) antara lain: Eropa, Timur Mediterania, Asia Tenggara, dan Pasifik Barat. Hasil survey dari 11 Rumah Sakit di DKI Jakarta juga menunjukkan bahwa infeksi nosokomial masih menjadi permasalahan kesehatan. Dengan adanya masalah tersebut, Indonesia mempunyai kegiatan yaitu Pencegahan dan Pengendalian Infeksi Rumah Sakit (PPIRS). Salah satu komponen dari kegiatan tersebut adalah kebersihan tangan menggunakan antiseptik. Di Rumah Sakit, antiseptik yang disediakan mempunyai efektivitas yang berbeda. Perbedaan tersebut terjadi sesuai dengan lama waktu kontak antiseptik dengan udara luar di RSUD Kota Yogyakarta. Tujuan Penelitian: Untuk menganalisis pengaruh waktu kontak antiseptik dengan udara luar terhadap efektivitas hand hygiene berdasarkan angka kuman di RSUD Kota Yogyakarta. Metode: Jenis penelitian ini adalah penelitian kuantitatif menggunakan quasiexperimental studies dalam satu kelompok (one group pre test - post test design). Analisis data yang digunakan yaitu uji Kruskal-Wallis. Hasil dan Pembahasan: Dari penelitian ini didapatkan jumlah angka kuman menunjukkan hasil terendah pada antiseptik yang sudah dibuka seminggu dengan rata-rata penurunan angka kuman 1775±1397,96 CFU/cm2. Kemudian diikuti antiseptik yang baru dibuka dengan rata-rata penurunan angka kuman 1262,5±1191,93 CFU/cm2 dan antiseptik yang sudah dibuka sebulan dengan ratarata penurunan angka kuman 362,5±184,34 CFU/cm2. Dan tidak terdapat perbedaan penurunan angka kuman yang signifikan pada ketiga antiseptik dengan nilai signifikansi 0,140. Kesimpulan: Waktu kontak antiseptik dengan udara luar di RSUD Kota Yogyakarta tidak mempengaruhi angka kuman pada hand hygiene dengan antiseptik tersebut dan angka kuman pada hand hygiene dengan antiseptik yang segera kontak dengan udara luar lebih tinggi daripada antiseptik sudah dibuka seminggu namun lebih rendah daripada antiseptik sudah dibuka sebulan.