Latar Belakang: Insiden periodontitis dilaporkan cukup tinggi di Indonesia, penyakit ini merupakan penyebab utama kehilangan gigi pada kelompok usia 35 tahun keatas. Periodontitis adalah suatu inflamasi pada jaringan pendukung gigi. Actinobacillus actinomycetemcomitans merupakan salah satu penyebab terjadinya periodontitis kronik. Salah satu tumbuhan yang diharapkan dapat menghambat pertumbuhan bakteri Actinobacillus actinomycetemcomitans adalah pepaya (Carica papaya L.) yang mana ekstrak bijinya memiliki kandungan senyawa aktif berupa saponin, flavonoid, alkaloid dan triterpenoid. Tujuan Penelitian: Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan efektivitas daya antibakteri ekstrak biji pepaya (Carica papaya L.) terhadap pertumbuhan bakteri Actinobacillus actinomycetemcomitans, serta untuk mengetahui konsentrasi ekstrak biji papaya yang memiliki daya antibakteri paling efektif terhadap pertumbuhan bakteri Actinobacillus actinomycetemcomitans. Metode Penelitian: Penelitian ini merupakan penelitian yang bersifat eksperimental laboratoris (in vitro). Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Universitas Muhammadiyah Yogyakarta pada bulan Agustus 2014. Penelitian dilakukan dengan metode houl plate diffusion dengan jumlah 25 sampel yang dibagi ke dalam 5 kelompok perlakuan. Sumuran dengan diameter 5mm dibuat pada media TSA (Triptic Soy Agar) sebagai media pertumbuhan bakteri dengan cara melubangi media menggunakan pipet pelubang. Ekstrak biji pepaya berbagai konsentrasi (100%, 50%, 25%), tetrasiklin sebagai kontrol positif dan aquades steril sebagai kontrol negatif diteteskan pada masing-masing sumuran sehingga akan didapat area bening yang merupakan zona hambat bakteri. Pengukuran besarnya zona hambat dilakukan menggunakan sliding caliper. Hasil Penelitian: Hasil yang diperoleh dianalisis menggunakan uji One Way ANOVA, hasilnya menunjukkan nilai signifikansi p<0.05 yang berarti bahwa terdapat perbedaan efektivitas zona hambat dari kelima kelompok perlakuan. Uji Post Hoc LSD menunjukkan bahwa masing-masing kelompok perlakuan memiliki perbedaan yang signifikan. Konsentrasi ekstrak yang memiliki daya antibakteri paling efektif dilihat dari besarnya zona hambat yang ditimbulkan yaitu ekstrak 100%. Kesimpulan: Terdapat perbedaan efektivitas daya antibakteri ekstrak biji pepaya (Carica papaya L. terhadap pertumbuhan bakteri Actinobacillus actnomycetemcomitans. Ekstrak dengan konsentrasi 100% memiliki daya antibakteri paling efektif.