Cuci tangan telah terbukti sebagai salah satu upaya kesehatan masyarakat yang sangat penting. Kebiasaan cuci tangan telah menunjukkan keberhasilan yang luar biasa dalam mencegah infeksi. Menurut WHO dalam program keselamatan pasien, kebersihan tangan merupakan salah satu program keselamatan pasien. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui adakah hubungan antara pengetahuan, sikap dan perilaku tenaga kesehatan tentang cuci tangan sebelum melakukan tindakan medis. Jenis penelitian ini adalah observasional deskriptif dengan rancangan cross sectional. Jumlah sampel sebanyak 30 responden tenaga kesehatan yang nekerja di bangsal bayi dan anak RSU PKU Muhammadiyah Yogyakarta. Data didapatkan dari pengisian kuesioner yang terdiri dari 3 bagian, yaitu pengetahuan, sikap, dan perilaku.