Latar Belakang: Pencegahan infeksi merupakan suatu bentuk upaya menjaga keselamatan pasien dalam pelayanan kesehatan di rumah sakit. Namun, banyaknya tenaga kesehatan yang memiliki pengetahuan yang rendah, sikap yang tidak sesuai dan ketidakpatuhan dalam penerapan standard precautions membuat banyaknya angka infeksi yang didapat di rumah sakit. Metode: Penelitian observasional analitik dengan rancangan crosssectional. Mengetahui pengetahuan, sikap dan kepatuhan terhadap 99 tenaga kesehatan yang terdiri dari perawat dan bidan dalam penerapan standard precautions di ruang rawat inap, intensive care unit dan ruang bersalin Rumah Sakit PKU Muhammadiyah Bantul selama bulan Juli sampai Agustus 2017. Analisis data menggunakan multiple logistic regression. Hasil: Terdapat tiga hal yang dinilai dalam penerapan standard precautions yaitu pengetahuan, sikap dan kepatuhan. Semua aspek dinilai berpengaruh terhadap penerapan standard precautions di RS PKU Muhammadiyah Bantul. Kepatuhan merupakan yang paling berpengaruh terhadap penerapan standard precautions dalam pencegahan hospital-acquired infections. Kesimpulan: Pengetahuan, Sikap dan Kepatuhan memiliki pengaruh yang signifikan terhadap penerapan standard precautions dalam pencegahan hospital-acquired infections.