Hospital Associated Infection (HAIs) masih menjadi permasalahan di dunia. Salah satu penyebabnya karena kepatuhan hand hygiene petugas kesehatan masih rendah. Penyebaran HAIs tersebut 80% ditularkan melalui tangan. Petugas non medis di rumah sakit merupakan salah satu petugas yang memiliki risiko menularkan patogen melalui tangan, karena petugas non medis tetap memiliki peluang yang besar berada pada salah satu dari 5 momen penting hand hygiene. Simulasi hand hygiene merupakan salah satu jenis pelatihan yang dilaksanakan setiap pergantian shift jaga petugas non medis, guna membentuk perilaku dan meningkatkan kepatuhan petugas non medis dalam melaksanakan hand hygiene. Penelitian ini adalah penelitian kuantitatif dengan desain quasy experimental dan teknik one group pre-posttest design. Populasi adalah semua petugas non medis di bagian kemanan, gizi, dan kebersihan RS PKU Muhammadiyah Yogyakarta Unit II, jumlah sampel 37 orang. Uji analisis menggunakan uji T berpasangan untuk mengetahui perbedaan perilaku patuh sebelum dan sesudah simulasi hand hygiene. Hasil penelitian didapatkan, pelaksanaan hand hygiene sesuai dengan prosedur yang benar sebesar 0,55%. Tingkat kepatuhan meningkat menjadi 13,83% setelah dilakukan intervensi. Uji statistik menunjukkan hasil yang signifikan, dimana nilai p<0,05; p=0,026 untuk petugas kemanan, p=0,027 untuk petugas gizi, dan p=0,002 untuk petugas kebersihan, artinya terdapat perbedaan perilaku patuh sebelum dan setelah pemberian simulasi hand hygiene pada petugas non medis. Simulasi hand hygiene pada petugas non medis efektif dalam meningkatkan kepatuhan hand hygiene petugas non medis.