Latar belakang: Unit laboratorium merupakan salah satu unit penunjang utama dalam pelayanan rumah sakit. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pelaksanaan identifikasi pasien dan spesimen berdasarkan SPO di laboratorium RS PKU Muhammadiyah Gamping. Metode: Penelitian ini menggunakan mixed methods research yaitu metode kuantitatif dan kualitatif. Data kuantitatif didapatkan dengan observasi moment menggunakan check list dan data kualitatif didapatkan dengan wawancara. Hasil dan Pembahasan: Pelaksanaan identifikasi pasien dan spesimen di unit laboratorium RS PKU Muhammadiyah Gamping belum sepenuhnya sesuai dengan SPO. Berdasarkan 100 observasi, penulisan data pasien pada lembar permintaan pemeriksaan laboratorium 77% tidak lengkap, hanya 74% petugas yang memastikan identitas pasien dengan benar, 84% petugas melakukan verifikasi nama dan tanggal lahir pasien dan hanya 45% petugas menempelkan label yang telah diverifikasi di tabung spesimen bersamaan dengan keberadaan pasien. Hambatan dalam pelaksanaan identifikasi pasien dan spesimen adalah budaya dalam keselamatan pasien yang masih kurang, kelengkapan pengisian lembar permintaan masih kurang, banyaknya jumlah permintaan pemeriksaan laboratorium dan kurangnya evaluasi. Simpulan dan Saran: Rumah sakit harus memberikan dukungan yang maksimal pada penerapan budaya keselamatan pasien, baik dari jumlah tenaga kesehatan yang memadai, perbaikan sarana dan prasarana, perbaikan kebijakan, pelatihan-pelatihan dan evaluasi.