Frekuensi penggunaan smartphone oleh tenaga kesehatan di rumah sakit yang tinggi dapat menyebabkan penyebaran bakteri dan kontaminasi silang ke pasien dengan smartphone sebagai perantaranya. Smartphone yang dirancang dengan layar sentuh memungkinkan terjadinya kontaminasi bakteri dari tangan tenaga kesehatan. Tujuan: Mengetahui jumlah rata-rata angka kuman yang diisolasi dari telapak tangan dan smartphone tenaga kesehatan, dan mengetahui adanya perbedaan rata-rata angka kuman yang diisolasi dari telapak tangan dan smartphone tenaga kesehatan di RS PKU Muhammadiyah Gamping. Metode Penelitian: Jenis penelitian ini adalah penelitian observasional analitik dengan desain cross sectional pada 56 tenaga kesehatan di RS PKU Muhammadiyah Gamping Yogyakarta. Penelitian ini dilaksanakan pada Juni 2019-Agustus 2019. Perhitungan angka kuman mengunakan metode streak plate di laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Yogyakarta. Hasil Penelitian: Hasil analisis data dari 56 responden 75% perempuan dan 25% lakilaki didapatkan rata-rata angka kuman yang diisolasi dari telapak tangan tenaga kesehatan sebesar 23 CFU/cm2. Angka kuman yang diisolasi dari layar smartphone tenaga kesehatan didapatkan rata-rata 15 CFU/cm2. Uji analisis perbedaan angka kuman tangan dan angka kuman pada smartphone tenaga kesehatan menggunakan uji Mann-Whitney diperoleh nilai p=0,014 (p<0,05), maka dapat disimpulkan bahwa ada perbedaan antara angka kuman tangan dan angka kuman pada smartphone tenaga kesehatan di RS PKU Muhammadiyah Gamping. Kesimpulan: Ada perbedaan antara angka kuman telapak tangan dan angka kuman pada layar smartphone tenaga kesehatan di RS PKU Muhammadiyah Gamping dengan rata-rata angka kuman telapak tangan sebesar 23 CFU/cm2dan angka kuman pada layar smartphone sebesar 15 CFU/cm2.