Latar Belakang: Healthcare Acquired Infections (HAIs) merupakan infeksi yang terjadi pada pasien selama proses perawatan di rumah sakit atau fasilitas kesehatan lainnya yang tidak didapatkan saat atau sebelum pasien masuk ke rumah sakit. Menurut WHO (2010) prevalensi HAIs di Indonesia mencapai 7,1%. HAIs dapat meningkatkan resiko kematian, memperpanjang lamanya rawat inap, dan pengeluaran biaya rawat inap yang lebih tinggi. penggunaan alat pelindung diri (APD) sangat penting untuk melindungi mukosa - mulut, hidung dan mata dari tetesan dan cairan yang terkontaminasi. Tujuan Penelitian: Untuk mengetahui hubungan pengetahuan dengan kepatuhan penggunaan Alat Pelindung Diri pada petugas penunjang medis di Rumah Sakit PKU Muhammadiyah Gamping. Metode: Jenis penelitian ini adalah penelitian kuantitatif dengan desain observasional atau non eksperimental yang merupakan metode penelitian secara observasional analitik dengan rancangan cross sectional. Menggunakan 38 responden yang diambil teknik total sampling. Analisis data yang digunakan untuk mengetahui hubungan antara pengetahuan dengan kepatuhan penggunan APD dengan menggunakan uji Fisher’s Exact Test dan spearman correlation. Hasil dan Pembahasan: dari penelitian ini didapatkan sebanyak 31 responden (81%) mempunyai pengetahuan baik dan 26 responden (68%) patuh dalam penggunaan APD. Terdapat hubungan yang signifikan antara pengetahuan dengan kepatuhan penggunaan APD dengan nilai signifikansi 0,022. Tingginya pengetahuan mengenai APD tidak berhubungan dengan tingginya kepatuhan penggunaan APD dengan nilai signikansi 0,094. Kesimpulan: Terdapat hubungan yang signifikan antara pengetahuan dengan kepatuhan penggunaan alat pelindung diri pada petugas penunjang medis di RS PKU Muhammadiyah Gamping dan tingginya pengetahuan petugas mengenai APD tidak berhubungan dengan tingginya kepatuhan penggunaan APD pada petugas penunjang medis RS PKU Muhammadiyah Gamping.