Latar Belakang : Smartphone memberikan keuntungan bagi tenaga kesehatan dalam komunikasi dan akses informasi, tetapi smartphone yang terkontaminasi kuman membahayakan pasien di rumah sakit. Perilaku pengguna smartphone merupakan salah satu faktor kontaminasi kuman pada smartphone. Tujuan : Untuk mengetahui faktor perilaku yang mempengaruhi cemaran kuman pada smartphone tenaga kesehatan. Metode : Penelitian analitik observasional dengan desain cross sectional. Penelitian dilakukan di RS PKU Muhammadiyah Gamping pada April-Juni 2018. Responden penelitian adalah 94 tenaga kesehatan yang memenuhi kriteria inklusi, yaitu tenaga kesehatan yang memiliki dan membawa smartphone. Setiap responden mengisi kuesioner. Smartphone tenaga kesehatan dilakukan swab, dikultur di media TSA, diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam, dan dilakukan pengecatan gram. Analisis data menggunakan uji Mann-Whitney. Hasil : Smartphone tenaga kesehatan di RS PKU Muhammadiyah Gamping tercemar kuman batang gram negatif dan kokus gram positif dengan rata-rata angka kuman sebanyak 98,13±196,61 CFU (95% CI 57,86-138,40). Hasil analisis statistik menunjukkan terdapat pengaruh bermakna frekuensi penggunaan smartphone di rumah sakit (p=0,034), tidak terdapat pengaruh bermakna penggunaan smartphone ketika melakukan pemeriksaan atau tindakan perawatan (p=0,182), dan tidak terdapat pengaruh bermakna pembersihan smartphone setiap hari (p=0,344) terhadap cemaran kuman pada smartphone tenaga kesehatan di RS PKU Muhammadiyah Gamping. Kesimpulan : Angka kuman yang diisolasi dari smartphone tenaga kesehatan di RS PKU Muhammadiyah Gamping adalah 98,13±196,61 CFU. Terdapat pengaruh frekuensi penggunaan smartphone terhadap cemaran kuman pada smartphone tenaga kesehatan di RS PKU Muhammadiyah Gamping. Tidak terdapat pengaruh penggunaan smartphone ketika melakukan pemeriksaan atau tindakan perawatan terhadap cemaran kuman pada smartphone tenaga kesehatan di RS PKU Muhammadiyah Gamping. Tidak terdapat pengaruh pembersihan smartphone setiap hari terhadap cemaran kuman pada smartphone tenaga kesehatan di RS PKU Muhammadiyah Gamping.