Tanaman anggrek hitam merupakan tanaman yang unik dan banyak digemari masyarakat. Eksploitasi secara besar-besaran dan pembangunan dalam wilayah habitat anggrek hitam menyebabkan kepunahan spesies ini. Melestarikan keanekaragaman hayati melalui kultur In vitro dapat mengantisipasi kepunahan tanaman tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji efektivitas pengaruh penggunaan media pumpkin dan konsentrasi yang paling tepat terhadap pertumbuhan anggrek hitam secara In vitro. Penelitian dilaksanakan pada bulan April 2019 hingga Juni 2019 di Laboratorium Kultur In vitro, Fakultas Pertanian, Universitas Muhammadiyah Yogyakarta. Metode yang digunakan yaitu metode percobaan laboratorium faktor tunggal yang disusun dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL) dan terdiri 6 perlakuan dan masing-masing memiliki 3 ulangan. Setiap ulangan terdiri atas 3 sampel sehingga terdapat 54 unit. Perlakuan yang dicobakan yaitu multiplikasi anggrek hitam pada media pupuk daun yang ditambahkan air kelapa dan pumpkin dengan berbagai konsentrasi yaitu diantaranya daging pumpkin 5 g/l, 10 g/l, 15 g/l dan 20 g/l. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan pumpkin pada media pupuk daun dan air kelapa dapat menggantikan media MS pada subkultur anggrek hitam. Penambahan pumpkin 15 g/l dalam media pupuk daun memberikan persentase eksplan hidup terbaik dan saat munculnya akar.