Latar belakang: Kelelahan mata adalah sekumpulan gejala yang terjadi akibat upaya yang berlebihan dari sistem penglihatan yang berada dalam kondisi kurang sempurna untuk memperoleh ketajaman penglihatan. Penggunaan komputer secara berlebihan dapat meningkatkan risiko terjadinya kelelahan mata selain disebabkan oleh faktor lain seperti alat dan durasi kerja. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui hubungan tingkat pengetahuan mengenai dampak negatif penggunaan komputer jangka lama dengan kejadian kelelahan mata. Metode: Penelitian ini merupakan penelitian non eksperimental yang bersifat kuantitatif dengan rancangan cross sectional. Subjek penelitian adalah pegawai UMY yang berjumlah 70 orang yang berusia 30 sampai 60 tahun. Penelitian dilakukan dari bulan Agustus hingga November 2016. Data penelitian didapat dengan menggunakan kuesioner yang diisi sendiri oleh responden untuk mengetahui karakteristik, tingkat pengetahuan dan keluhan kelelahan mata secara subjektif. Hasil: Dari 70 responden, kelelahan mata terjadi pada 47 responden (67,1%). Hasil analisis statistik antara tingkat pengetahuan pegawai UMY dengan kejadian kelelahan mata menggunakan uji chi-square menunjukkan hasil yang tidak signifikan dengan nilai p sebesar 0,087 (p>0,05). Kesimpulan: Tidak terdapat hubungan yang signifikan antara tingkat pengetahuan dengan kejadian kelelahan mata pada pegawai UMY dengan nilai p=0,08 (p>0,05).